摘 要：目的 對明德生物QMT8000免疫定量分析儀檢測降鈣素原(PCT)的主要方法學性能進行驗證與評價。方法 參考美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)系列文件，結合實際工作設計驗證方案，對免疫定量分析儀檢測全血PCT 的精密度、線性、可比性、抗干擾能力等4項分析性能進行驗證和評價。結果 該定量方法操作簡便、快速，整個檢測過程約17min;PCT 定量時，批內、批間精密度為1.26%～3.96%;檢測線性良好，相關系數r大于0.99，回歸方程檢驗有意義(P<0.05)，與廠商宣稱范圍接近;該定量法與半定量法檢測結果一致性達92%;三酰甘油、膽紅素對檢測結果無明顯影響，溶血可使檢測結果顯著偏高(P<0.05)。結論 該科室引進的降鈣素原免疫定量分析儀操作簡便、主要性能評價良好，可滿足臨床指導抗菌藥物的應用等需要。
降鈣素原(PCT)即降鈣素前體，是一種無激素活性的糖蛋白。生理情況下，甲狀腺C細胞可產生極少量的PCT，健康人的血液PCT水平通常測不到，血液濃度小于0.5μg/L;細菌感染時，除甲狀腺外，肝臟的巨噬細胞和單核細胞，肺、腸道組織的淋巴細胞及內分泌細胞都能合成分泌PCT，此時血清PCT 水平會明顯升高，且隨著感染進展或控制而持續升高或逐漸下降。Dandona等認為細菌內毒素是誘導PCT 產生的最主要刺激因子，健康人注射少量的細菌內毒素就能刺激PCT的合成。早在2001年國際膿毒癥會議，PCT已被定為膿毒癥診斷標準的指標之一，現在PCT水平已作為一個新的炎癥指標，廣泛應用于感染性疾病的診斷、鑒別診斷、病情監測及抗菌藥物應用指導等。降鈣素原的檢測方法有半定量法和定量法。半定量法通常利用膠體金免疫層析技術，定量法以往多為化學發光法。本科室新引進的一臺免疫定量分析儀，是以免疫層析為基礎而研發的定量檢測方法，第一步采用固相免疫膠體金層析技術，利用雙抗體夾心法檢測人全血中的PCT，出現質控線和檢測線，第二步采用圖像分析處理技術，通過采集PCT檢測試劑卡中質控線和檢測線的圖像，獲得濃度信號，分析軟件自動將濃度密度值與標準曲線比較分析，即可得出被測樣本中PCT的定量結果。 現就其主要檢測性能作出評價。
1 材料和方法
1.1 檢測樣本 本院門/急診及住院患者經乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝的靜脈血樣本50份，其中PCT 高值血樣來自細菌培養陽性的患者。三酰甘油含量為6.02 mmol/L 的乳糜樣本;總膽紅素含量為184.2μmol/L 的黃疸樣本。
1.2 儀器與試劑 降鈣素原免疫定量分析儀、降鈣素原檢測試劑盒均由武漢明德生物科技股份有限公司生產。
1.3 方法
1.3.1 精密度試驗 選擇PCT 高值34μg/L、低值0.23μg/L的臨床樣本各一份，同時檢測20次作批內精密度測試;以質控卡(22～26μg/L)為檢測對象，每天隨臨床標本同時檢測，連續20天作批間精密度測試，同時做質量控制分析。
1.3.2 線性 按參考文獻和CLSL 的EP6-A2 文件方法，本試驗以稀釋液空白代替低濃度(L)，以PCT 濃度值為34μg/L的患者樣本作為高濃度(H)，按20L、19L+1H、18L+2H、16L+4H、12L+8H、8L+12H、4L+16H、2L+18H、20H 的關系配制，形成系列濃度全血。每個標本重復測量2次，記錄結果。將實測值與理論值作比較，作直線回歸方程。
1.3.3 可比性 本研究共收集了50 例標本，先進行半定量PCT 測定，隨后用定量分析儀檢測PCT 的具體含量，比較二者檢測結果的一致性。將分離后的血清200μL 或400μL 加到反應孔中，觀察反應區的顏色變化。在出現紅色對照帶的前提下，如加入的總血清量為200μL，比照200μL 的比色卡讀出PCT 的大致范圍(結果分為小于0.5μg/L，≥0.5μg/L，≥2μg/L，≥10μg/L);如加入的總血清量為400μL，比照400μL的比色卡讀出PCT 的大概范圍(結果分為小于25μg/L，≥0.25μg/L，≥1μg/L，≥5μg/L)。
1.3.4 干擾試驗 按參考文獻和CLSL 的EP6-A2文件方法，分別將乳糜樣本、黃疸樣本按20L、19L+1H、18L+2H、16L+4H、12L+8H、8L+12H、4L+16H、2L+18H、20H 的關系用生理鹽水配制，形成系列濃度血樣，然后將系列濃度的干擾物與待測全血等量混合，在免疫定量分析儀上檢測2次，取均值。根據文獻計算影響度。影響度=[(加入干擾物血樣測定值- 未加入干擾物血樣測定值)/未加入干擾物血樣測定值]×100%。取同日被檢的10份臨床標本，原PCT 檢測值為A 組;用帶有針頭的一次性注射器，反復抽打上述10份標本至肉眼可判斷為溶血，再次檢測得出的B組結果，比較其與A 組值之間的統計學差異。
1.4 統計學處理 采用SPSS17.0軟件進行配對t檢驗與回歸方程分析，P<0.05認為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 精密度驗證 樣品檢測20次，批內、批間精密度試驗結果見表1，基本符合NCCLSEP5-A2文件推薦的小于5%的標準。
(表1)2.2 線性評價和檢測限 PCT 系列濃度標本測定結果見表2，以理論值為x，實測均值為Y，建立Y=a+bX的回歸方程，PCT 回歸方程為Y=0.533+0.969X，r=0.998，決定系數r2為0.996。F顯著性檢驗：F=1510.4，P<0.05，回歸方程有意義。同時，由表2可看出，免疫定量分析儀的檢測下限為0.1μg/L，與廠商提供的一致。
(表2)2.3 比對試驗 參照文獻制定不同半定量范圍內的PCT與定量PCT 檢測結果是否一致的判斷標準。由表3可以看出，兩種方法檢測結果一致率達92%，僅8% 的標本檢測結果有偏差。
(表3)2.4 干擾試驗 將系列濃度的乳糜和黃疸干擾物與待測全血等量混合，測定值及影響度見表4、5。將10份標本溶血處理前后得到的結果做配對t檢驗，t=-3.554，P<0.05，說明溶血后檢測結果顯著升高。
(表4)
(表5)3 討論PCT 作為細菌性感染最特異的指標之一，臨床應用越來越廣泛，如膿毒癥的診斷與監測：血液中PCT 濃度小于表示膿毒癥的可能性低、>2μg/L 表示極可能為膿毒癥，發展至重癥膿毒癥和/或膿毒癥性休克的風險較高、在0.5～2.0μg/L 之間時，需結合患者的病史來判定結果;細菌性與非細菌性感染的鑒別診斷：血液PCT 升高多由于細菌性感染，而PCT 無明顯升高則可能是其他原因導致的感染，包括創傷、外科手術、重癥胰腺炎、腫瘤浸潤等;臨床抗菌藥物應用的指導：PCT 濃度<0.1μg/L，不建議使用抗菌藥物;在0.1～0.25μg/L 之間，不鼓勵使用抗菌藥物;在0.25～0.50μg/L之間，建議使用抗菌藥物;>0.5μg/L 時，強烈建議使用抗菌藥物等。本科室新引進一臺降鈣素原免疫定量分析儀，其檢測參數的準確性直接影響臨床診斷及治療，因此需要對其主要分析性能進行驗證與評價。選取兩份臨床標本，分別在高、低兩個水平驗證免疫定量分析儀檢測全血PCT 的精密度。結果表明，該儀器的檢測精密度為1.26%～3.96%。在儀器說明書顯示的范圍內，也達到了國際公認的質量要求。每日的質控卡檢測結果均在正常范圍內，說明儀器在控，檢測結果均可信。選擇1份線性高值的樣品配成系列濃度水平用理論值與實測值作回歸分析得出PCT的回歸方程Y=0.533+0.969X(X為理論值)，r=0.998，決定系數r2為0.996。表明線性良好，與儀器說明書上的結果基本一致，也達到公認的質量要求。為驗證免疫定量分析儀的可靠性，本研究比較了2種不同方法的檢測結果，由于一種是定量檢測，一種是半定量檢測，檢測結果不能進行相關性分析，若按照半定量PCT 檢測方法中小于0.25μg/L 作為陰性值的判斷標準，則從檢測結果陰陽性的角度考慮，其中46 例二者的檢測結果一致，一致率高達92%，說明免疫定量分析儀檢測結果較為可靠。干擾試驗表明，加入三酰甘油、膽紅素前后，檢測結果無明顯變化，影響度均小于5%，說明三酰甘油、膽紅素不引起干擾效應，該方法檢測特異性較好。另外，對標本進行人為溶血處理后，檢測結果表明10份標本PCT 水平均明顯升高。Schuetz等已證實，內毒素和炎癥介質刺激后，外周血單核細胞(PBMC)中ProCT mRNA 上調近一倍，各白細胞亞群亦表現出不同程度ProCT 蛋白增加。因此，當單核細胞破碎后，細胞內的PCT 釋放，可造成全血PCT 水平的升高。降鈣素原免疫定量分析儀為融合了膠體金免疫層析技術的定量檢測方法，既避免半定量法主觀判斷帶來的人為誤差，又較化學發光法定量法操作簡便，且用血量較少，使檢測過程更為客觀、科學、方便。其次，使用EDTA-K2抗凝的全血代替血清，可與急性時相反應蛋白(CRP)一起作為血常規檢查的附加項目，縮短了檢測周期，可使患者及時得到檢驗結果，方便臨床醫生參考、確定抗菌藥物治療方案，既能及時控制炎癥，又能避免抗菌藥物的濫用。
綜上，本文對免疫定量分析儀檢測PCT 的主要分析性能進行驗證，其結果與廠商承諾的性能指標基本一致，也與公認的質量指標基本一致;且它是一款具有操作簡便、精密度高、線性好、檢測范圍廣、結果重復性好、抗干擾能力強、檢測速度快等優點的定量檢測儀，可在實際工作中應用并推廣。然而，該方法仍存在一定的不足，如溶血樣本對檢測結果有干擾，應避免使用溶血樣本;某些含有抗試劑盒中某種成分的抗體的樣品可能會影響檢驗結果的準確性;可能存在假陽性、假陰性結果等。因此檢驗結果仍需臨床醫生結合患者的病史及所進行的所有其他化驗結果來判定，臨床確診應由專業人員結合患者臨床癥狀、體征以及輔助檢查等其他診斷依據進行綜合判斷。
參考文獻(略)陳 燕，李文靜 ，石冬敏南京醫科大學附屬蘇州市立醫院本部檢驗科，江蘇蘇州215002
