01.關于EB病毒
EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)為皰疹病毒科，皰疹病毒IV型，是一種嗜人類淋巴細胞的皰疹病毒。EBV是雙鏈DNA病毒，基因組長約172kb，在病毒顆粒中呈線性分子，進入受感染細胞后，其DNA發生環化并能自我復制。淋巴細胞中潛伏感染的EBV可表達2種不翻譯成蛋白質的RNA(即EBV-encoded RNAs, EBERs)，包括EBER1和EBER2，6種核抗原(EBNA1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C和LP)，2種潛伏期膜蛋白(潛伏膜蛋白，latent membrane protein, LMP)，包括LMP1、LMP2A/B。
EBV在人群中感染非常普遍，約90%以上的成人血清EBV抗體陽性。除原發性EBV感染可致傳染性單核細胞增多癥(infectious monon-ucleosis, IM)外，EBV還引起慢性活動性EBV感染(chronic active EBV infection，CAEBV)和EBV相關噬血細胞性淋巴組織細胞增生癥(EBV-associated haemophagocytic lymphohistiocytosis，EBV-HLH)等非腫瘤性重癥EBV相關疾病。EBV還是一種致腫瘤病毒，與許多腫瘤的發生相關，如霍奇金淋巴瘤(Hodgkinlymphoma，HL)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkinlymphoma，NHL)，鼻咽癌(nasoph-aryngeal carcinoma，NPC)，胃癌和移植后淋巴細胞增殖癥(post-transplant lymphoproliferative disorder，PTLD)等。
EBV原發感染后建立終身潛伏感染。EBV潛伏感染可分為四種類型。在健康的EBV既往感染個體，EBV在記憶性B細胞潛伏，只表達EBERs，稱為EBV潛伏感染0型，這些個體稱為健康攜帶者。在EBV感染相關疾病中，EBV有三種潛伏感染類型。潛伏感染Ⅰ型，除EBERs外，EBV只表達EBNA1和BamHI A右側片段(BARTs)，如Burkitt’s淋巴瘤;潛伏感染Ⅱ型，EBV表達EBNA1、LMP1、LMP2、BARTS和EBERs，如鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤;潛伏感染Ⅲ型，EBV表達所有的潛伏感染基因，如免疫抑制病人的淋巴組織增生性疾病(表1)。
表1 EBV感染類型與EBV相關疾病
Tab.1 Patterns of Epstein-Barr virus (EBV) infection and EBV-associated diseases
針對不同的EBV感染相關疾病，選擇適當的臨床標本和實驗室檢測方法，對于EBV感染相關疾病的診斷和治療十分重要。為提高國內EBV感染相關疾病的診治水平，特組織病毒學、臨床和實驗室診斷等方面的專家，參考國內外最新研究成果，制定此專家共識，以規范EBV實驗室診斷方法的臨床應用。
02
EBV感染實驗室診斷方法
2.1 EBV特異性抗體檢測
2.1.1 特異性抗體譜：
EBV編碼多種結構抗原，包括病毒衣殼抗原(viral capsid antigen，VCA)、早期抗原(early antigen，EA)、膜抗原(membrane antigen，MA)、核抗原(nuclear antigen，NA)等。機體感染EBV后針對不同的抗原產生相應的抗體(圖1)。原發性EBV感染過程中首先產生針對VCA的IgM和IgG(抗VCA-IgM/IgG);在急性感染的后期，抗EA-IgG出現;在恢復期晚期，抗EBV核抗原(EBNA)IgG產生。目前主要用于實驗室檢測的EBV特異性抗體包括抗VCA-IgG、抗VCA-IgM和抗EBNA-IgG。另外，抗VCA-IgA和抗EA-IgA陽性提示持續性EBV抗原刺激，常用于CAEBV或EBV相關腫瘤的診斷和監測。
圖1 EBV原發感染和既往感染后抗體滴度變化
Fig.1 Serological titersdistinguish primary infection from remote infection
2.1.2 抗體親和力：
機體在初次接觸病原體時產生的特異性IgG抗體對相應抗原的親和力隨著免疫反應的進行會逐漸升高，抗VCA-IgG抗體親和力的檢測可幫助鑒別EBV原發感染和既往感染，其檢測方法包括免疫熒光或酶聯免疫方法。
有研究報道，所有原發性急性EBV感染患者在剛剛出現臨床癥狀時，抗VCA-IgG抗體均為低親和力;在出現臨床癥狀10 d內，90%以上的患者可檢測到抗VCA-IgG低親和力抗體;在病程20～30 d后，50%患者的抗VCA-IgG抗體仍為低親和力抗體;既往感染病例血清中抗VCA-IgG抗體則均為高親和力抗體。因此，低親和力抗VCA-IgG抗體提示原發性急性感染。聯合抗EBNA-IgG陰性和低親和力抗VCA-IgG抗體，其診斷原發性EBV感染的敏感性和特異性可達到100%。抗體親和力檢測也存在局限性：對于不同個體，抗體成熟率不同;新生兒及小嬰兒由于母傳抗體的存在也不適用抗體親和力檢測。
2.1.3 檢測方法及標本類型：
EBV特異性抗體檢測的適宜標本為血清或血漿，檢測方法主要包括免疫熒光法、免疫酶法、酶聯免疫法、化學發光法、免疫印跡法等，其中酶聯免疫法和化學發光法由于可以實現自動化檢測，在臨床應用較為廣泛。
2.1.4 臨床意義：
對于免疫功能正常的患者，一般情況下結合抗VCA-IgM、抗VCA-IgG和抗EBNA-IgG3個抗體的檢測結果可以區分EBV原發感染和既往感染：抗VCA-IgG、抗VCA-IgM抗體陽性而抗EBNA-IgG陰性提示EBV原發感染，抗VCA-IgM陰性而抗VCA-IgG和抗EBNA-IgG陽性則是典型的EBV既往感染抗體類型(詳見表2)。但有的病例抗VCA-IgM產生延遲，有的則缺失或長時間存在，并且EBV再激活時也可能出現抗VCA-IgM，抗VCA-IgM有時也會出現假陽性(如人巨細胞病毒感染時)，4歲以下兒童抗VCA-IgM水平低且持續時間短;抗EA-IgG在原發感染后期出現，少數病例可能在原發感染后長時間檢出，并且EBV再激活時也可能出現抗EA-IgG;約5%的健康攜帶者缺失抗EBNA-IgG抗體，另外免疫抑制患者抗EBNA-IgG抗體也可能會丟失或水平很低;有的既往感染過EBV的患者抗VCA-IgG可能為陰性;鼻咽癌患者VCA-IgA和EA-IgA抗體滴度明顯高于健康攜帶者。因此EBV感染后血清學反應復雜多樣，有時給抗體結果解釋尤其是單份血清的抗體結果解釋帶來困難。
表2 免疫功能正常患者EBV血清學特點
Tab.2 Interpretation of Epstein-Barr virus serological profiles inimmunocompetent patients
根據EBV感染過程中抗體產生的不同動力學特點，同時檢測患者血清中幾種EBV抗體(抗VCA-IgM/IgG、抗EA-IgG及抗EBNA-IgG)和抗VCA-IgG親和力可以提高診斷原發性EBV感染的敏感性和特異性，幫助判斷原發性EBV感染、既往EBV感染或既往EBV感染再激活。
2.2 嗜異凝集抗體檢測
嗜異凝集抗體為IgM抗體，在病程第1～2周出現，在病程5周內達到高峰，隨后迅速下降，但是少數患者可以持續約6～12個月。在成人和青少年，85%～90%原發性EBV感染者會出現嗜異凝集抗體;但是大約只有50%的2～5歲兒童原發性EBV感染后此抗體為陽性，而小于2歲的兒童原發性EBV感染后此抗體的陽性率僅10%～30% 。
2.2.1 檢測方法及標本類型：
采用試管法或血凝反應板法，標本類型為血清或血漿。
2.2.2 臨床意義：
此抗體檢測缺乏特異性，其他急性感染如原發性巨細胞病毒感染、自身免疫性疾病或腫瘤等也可能呈陽性反應。國內兒童IM的發病高峰年齡為4～6歲，因此該抗體檢測在國內兒童IM的診斷中價值不大。因此，不推薦用于國內兒童EBV原發性感染所致IM的診斷。
2.3 EBV核酸載量檢測
EBV-DNA載量測定(最常用的標本是外周血)已經被廣泛應用于EBV相關疾病的診斷、病情監測、治療效果評估和預后判斷等。無菌體液(如肺泡灌洗液、腦脊液等)樣本也可檢測EBV-DNA，用于EBV相關疾病的輔助診斷。
2.3.1 檢測方法及標本類型：
檢測方法采用實時熒光定量PCR法，不同EBV相關疾病的適宜EBV-DNA檢測的樣本不同，詳見表3。
表3 不同EBV相關疾病中適用于EBV載量檢測的標本
Tab.3 Best specimen for EBV-load measurement in different Epstein-Barrvirus-associated diseases
2.3.2 臨床意義：
不同臨床樣本中EBV-DNA檢測結果的意義不同(見表3)。血清或血漿中EBV-DNA陽性提示患者體內存在活動性EBV感染或疾病與EBV密切相關(如原發EBV感染早期、EBV-HLH、大多數CAEBV、EBV相關腫瘤等)，需結合臨床表現及其他檢查結果綜合分析判斷;血清或血漿EBV-DNA陰性提示為血清陽性轉化的EBV健康攜帶者、未感染過EBV的患者、非EBV相關疾病患者、以及部分EBV相關疾病患者，如部分IM患者及IM后期，極少數CAEBV患者(結合血清學判定)。外周血PBMC中EBV-DNA載量高于102.5拷貝/μgDNA是CAEBV的診斷標準之一。全血樣本EBV-DNA載量主要用于免疫缺陷患者EBV感染的診斷，以提高診斷EBV感染的敏感性，不推薦用于有免疫力的患者。因血清EBV陽性轉化的健康攜帶者每106個PBMC中大約有1～50個EBV感染的細胞，約7個拷貝(1～30個拷貝)EBV-DNA/106PBMC。因此，血清陽性轉化的EBV健康攜帶者的全血或PBMC標本中可能檢出低水平的EBV-DNA載量。
2.4 EBERs原位雜交試驗
EBERs(EBER1/EBER2)是EBV編碼的不翻譯成蛋白質的RNA。EBERs大量存在于EBV潛伏感染的細胞中，每個細胞可達106～107拷貝，是EBV潛伏感染的最好標志物，其主要功能是抑制干擾素介導的抗病毒效應和凋亡。
2.4.1 檢測方法及標本類型：
采用原位雜交法，標本類型為病理組織或細胞涂片。
2.4.2 臨床意義：
原位雜交檢測EBERs能夠定位EBV感染的細胞類型，是明確腫瘤與EBV相關的金標準。
各種實驗室診斷方法采用的標本類型、檢測方法以及特點詳見表4。
表4 EBV感染實驗室診斷方法
Tab.4 Laboratory assays for Epstein-Barr virus infection
03
EBV實驗室診斷方法的臨床應用
EBV感染與多種臨床疾病相關，熟悉不同EBV感染實驗室診斷方法的優缺點，針對不同的EBV感染相關疾病，選擇適當的臨床樣本和實驗室檢測方法，對于EBV相關疾病的診斷和治療十分重要。
3.1 原發性EBV感染相關疾病
3.1.1 IM：
IM是原發性EBV感染引起的良性自限性疾病，其典型臨床表現為發熱、咽峽炎和頸淋巴結腫大的"三聯征"，外周血淋巴細胞顯著增多并出現異型淋巴細胞，可合并肝脾腫大和肝功能異常。多數預后良好，少數可出現嚴重并發癥，如噬血細胞性淋巴組織細胞增生癥(HLH)。
3.1.1.1 EBV特異性抗體檢測
對于免疫功能正常的患者，EBV特異性抗體檢測仍然是診斷IM的金標準。但是，如前所述，EBV感染后的血清學反應復雜多樣，根據EBV感染過程中不同抗體產生的動力學特點，同時檢測患者血清中3種EBV特異性抗體(抗VCA-IgM/IgG、抗EBNA-IgG)，并結合抗VCA-IgG親和力檢測，可提高原發性EBV感染診斷的敏感性。IM的EBV特異性抗體檢測指標包括(1)抗VCA-IgM和抗VCA-IgG陽性，且抗EBNA-IgG陰性;或(2)抗VCA-IgM陰性，但抗VCA-IgG陽性，且為低親和力抗體。
3.1.1.2 EBV核酸載量檢測
對診斷IM的陰性預測值較低，不必常規進行檢測，僅對EBV抗體檢測結果難以解釋的病例可能有所幫助。使用血清或血漿標本進行EBV-DNA檢測。因IM患者PBMC中EBV-DNA陽性可持續6個月以上，需要1年或更長時間達到EBV健康攜帶者的全血EBV-DNA水平(1-30拷貝EBV-DNA/106 PBMC)，因此，在IM的診治中需使用血清或血漿標本進行EBV-DNA載量檢測，不宜使用全血和PBMC樣本。
3.1.2 免疫缺陷患者EBV原發性感染(X連鎖淋巴增生癥，移植患者等)
3.1.2.1 EBV特異性抗體檢測
免疫缺陷患者(如移植患者接受免疫抑制劑治療)，體液免疫反應不足，并且由于接受輸血或者輸注免疫球蛋白的治療也會干擾血清抗體的檢測結果，因此免疫缺陷患者發生原發EBV感染時，血清特異性抗體檢測的價值有限。
3.1.2.2 EBV核酸載量檢測
由于免疫缺陷患者抗體反應往往不足，核酸載量檢測有助于原發EBV感染的診斷，推薦使用全血或PBMC標本進行EBV-DNA動態檢測。對于X連鎖淋巴增古癥患者，至少每6個月監測1次EBV-DNA;對于移植患者，移植后每周監測EBV-DNA至少3個月(可長至6個月)，以后每月監測EBV-DNA到移植后1年。
3.1.3 其他EBV原發性感染相關疾病(EBV腦膜炎或腦炎、心肌炎、間質性肺炎等)：
EBV感染幾乎可以累及各個臟器，有些患者EBV原發感染臨床表現不符合典型IM的臨床特征，而以某一臟器受累為主，如間質性肺炎、心肌炎及腦炎等。
3.1.3.1 EBV特異性抗體檢測
血清或血漿中的EBV特異性抗體檢測結果符合原發性EBV感染。
3.1.3.2 EBV核酸載量檢測
腦脊液標本EBV-DNA檢測陽性有助于EBV感染腦膜炎或腦炎的診斷;肺泡灌洗液標本EBV-DNA檢測陽性有助于EBV感染間質性肺炎的診斷。
3.1.3.3 EBERs原位雜交
病理組織樣本(如心肌活檢組織等)中EBERs原位雜交陽性結果，是明確本次疾病與EBV相關的最直接的證據。
3.2 持續性或再激活EBV感染相關疾病
3.2.1 CAEBV：
CAEBV是一種嚴重的EBV感染疾病，其臨床表現是IM樣癥狀持續或反復發作，并逐漸出現多種器官的慢性損害，如持續性肝功能損害、多發性淋巴結病、肝脾大、噬血細胞綜合征、視網膜炎、間質性肺炎、牛痘樣水皰病及蚊蟲叮咬過敏等。
3.2.1.1 EBV特異性抗體檢測
異常的EBV抗體水平是CAEBV的診斷標準之一。2005年Okano等提出的CAEBV診斷指南：EBV特異性抗體指標需要滿足抗VCA-IgG≥1∶640和抗EA-IgG≥1∶160，VCA-IgA和(或)EA-IgA也常陽性。但上述EBV抗體滴度的檢測方法均為免疫熒光方法，對于常規臨床實驗室檢測有一定困難。目前尚無免疫酶學方法對應的界定閾值。
3.2.1.2 EBV核酸載量檢測
CAEBV患者外周血中EBV載量較健康攜帶者明顯升高。CAEBV患者血清或血漿中EBV-DNA陽性，或外周血PBMC中EBV-DNA高于102.5拷貝/μg DNA。Kimura等對30名CAEBV患者的研究發現，所有CAEBV患者PBMC中EBV-DNA均為陽性，且高于102.5拷貝/μg DNA，盡管多數CAEBV患者PBMC中的EBV-DNA與血漿中EBV-DNA有較好的相關性，但是有6名患者血漿中EBV-DNA檢測為陰性。因此對于臨床懷疑CAEBV的患者，若血清或血漿標本EBV-DNA檢測為陰性，可以進一步采用外周血PBMC檢測EBV核酸載量，且CAEBV通常為高載量。
3.2.1.3 EBERs原位雜交
CAEBV患者受累器官的活檢組織標本和外周血中EBV感染的B/T/NK等細胞中EBERs陽性。
3.2.2 EBV-HLH：
EBV-HLH是淋巴細胞、巨噬細胞異常增生和活化，以發熱、肝脾腫大、血細胞減低、高甘油三脂血癥和(或)低纖維蛋白原血癥為特點的臨床綜合征，是一種嚴重威脅患者生命的過度炎癥反應綜合征。EBV原發感染和再激活均可引起EBV-HLH。
3.2.2.1 EBV特異性抗體檢測
EBV-HLH患者血清或血漿標本中特異性EBV抗體反應呈多種反應類型，可以呈EBV原發感染或EBV既往感染及再激活。
3.2.2.2 EBV核酸載量檢測
EBV-HLH患者血清/血漿中有高水平的EBV核酸載量，而且EBV核酸載量與治療反應具有很好的相關性，因此監測血清/血漿中EBV-DNA載量有助于評估治療效果。
3.2.2.3 EBERs原位雜交
EBV-HLH患者受累組織和外周血中EBV感染的B/T/NK等細胞中EBERs陽性。
3.3 腫瘤相關性疾病
3.3.1 NPC：
NPC是目前最為明確的與EBV感染相關的人類上皮性腫瘤，位列中國腫瘤發病率前10位，尤其在兩廣等南方地區發病率最高，故又被稱為"廣東癌"。在流行地區，WHO III型非角質化未分化(主要亞型)NPC腫瘤組織中幾乎全部可以檢測到EBV基因組。
3.3.1.1 EBV特異性抗體檢測
EBV相關NPC患者抗體檢測結果為EBV既往感染或再激活。抗VCA-IgA已經被證實是有助于NPC篩查診斷的一個生物標志物。Chen等最近的一項薈萃分析結果表明，血清抗VCA-IgA用于NPC診斷的敏感性和特異性可達到83%和88%。研究結果也同時提示，如果同時檢測其他抗體如抗Rta-IgG、抗EBNA1-IgA等則效果更好。并且，與免疫熒光法和酶聯免疫吸附法相比，免疫酶法檢測抗VCA-IgA用于NPC診斷的準確性更好。
3.3.1.2 EBV核酸載量檢測
最新的研究結果顯示，血清/血漿EBV-DNA可以用于NPC的篩查，尤其是對于無癥狀早期NPC病例，可能比VCA-IgA指標的敏感性更高;并且血漿EBV-DNA還可用于NPC患者治療后的監測以及預后判斷。
3.3.1.3 EBERs原位雜交
腫瘤細胞中EBERs陽性，可以明確NPC與EBV相關。
3.3.2 淋巴瘤：
EBV相關淋巴瘤主要包括HL和NHL，其中經典HL中的混合細胞型，NHL中的Burkitt淋巴瘤(非洲)以及結外NK/T細胞淋巴瘤(鼻型)與EBV密切相關。
3.3.2.1 EBV特異性抗體檢測
EBV相關淋巴瘤患者抗體檢測結果為EBV既往感染或再激活。
3.3.2.2 EBV核酸載量檢測
血清/血漿EBV-DNA可作為EBV相關淋巴瘤患者腫瘤負荷的一個標志物，并且可能用于治療效果評估和預后判斷。
3.3.2.3 EBERs原位雜交
腫瘤細胞中EBERs陽性，可以明確淋巴瘤與EBV相關。
3.4 PTLD
PTLD是實體器官移植或骨髓移植、造血干細胞移植后發生的一種嚴重并發癥，是移植后持續免疫缺陷下發生的一種由增生性到腫瘤性的淋巴系統增殖。大約80%～90%的PTLD與EBV感染有關，因此，移植患者監測EBV感染至關重要。
3.4.1 EBV特異性抗體檢測：
移植患者由于接受免疫抑制治療，體液免疫反應不足，并且由于接受輸血或者輸注免疫球蛋白的治療也會干擾血清抗體的檢測結果，因此血清特異性抗體檢測的價值有限。
3.4.2 EBV核酸載量檢測：
盡管EBV核酸載量陽性并不是PTLD確診的標準，但是動態監測EBV核酸載量、及時采取措施對于預防EBV相關PTLD的發生較為重要。全血標本是移植后患者EBV感染監測的最佳標本，具有較高的敏感性，但是其陽性預測值較低，特異性較差。結合全血和血清/血漿標本的EBV載量檢測結果，可以提高預測PTLD的敏感性和特異性;若全血EBV-DNA≥20 000拷貝/ml和血漿EBV-DNA≥ 1 000拷貝/ml,其預測PTLD發生的敏感性為100%、特異性為94% 。血漿中EBV核酸載量監測有助于評估PTLD治療效果。
3.4.3 EBERs原位雜交：
組織活檢病理是PTLD診斷的金標準，EBERs原位雜交是唯一能夠定位腫瘤細胞中存在EBV的實驗室方法，從而明確PTLD是EBV相關。
04
小結
了解EBV的病毒學特性及感染后的體液免疫學特點，熟悉不同EBV感染實驗室診斷方法的優缺點，根據不同疾病和病程合理選擇和應用不同的標本和實驗室診斷方法，對EBV感染相關疾病的診治極為重要。
資料：選自中華實驗和臨床病毒學雜志, 2018,32(1)
